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細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA 試劑盒

堿性磷酸酶

系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。

細(xì)胞色素C氧化酶（COX）ELISA 試劑盒

定量測定

ELISA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的*，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)值，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域。

測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線注意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達(dá)。

操作程序

1.   分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘。

2.   棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。

3.   每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4.   取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

5.   測定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

6.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。

親和素是一種糖蛋白，一分子親和素可以與四個生物素小分子發(fā)生專一親和作用，類似抗原與抗體親和。它們之間的作用力是目前已知強(qiáng)的非共價作用。80年代后，隨著生物素-親合素系統(tǒng)（BAS）作用被發(fā)現(xiàn)，這一親和作用被結(jié)合應(yīng)用到ELISA技術(shù)上，大大提高了后者反應(yīng)的靈敏性與專一性。生物素很易與蛋白質(zhì)（如抗體等）以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色，達(dá)到檢測未知抗原（或抗體）分子的目的。